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[主观题]

按适当的顺序,列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶。

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第1题
假设你需要将一段cDNA克隆到表达载体中并转化到大肠杆菌中。cDNA的两端和载体上均有BamHⅠ的酶切位点,你需要
用BamHⅠ切割eDNA和载体然后将它们连接在一起。下面是实验方法要求的具体步骤:a.用BamHⅠ处理载体DNA,然后用碱性磷酸酶去除5'端的磷酸基;b.用BamHⅠ处理cDNA,然后与步骤a中得到的载体DNA混合,加入DNA聚合酶,在适当的条件下使cDNA与载体连接;C.将步骤b的产物转入大肠杆菌感受态细胞中,培养后均匀涂在含有抗生素的琼脂培养皿上。

因为表达载体中含有抗性基因,能表达抵制抗生素的酶,所以只有含有载体的大肠杆菌才可以在含有抗生素的培养皿上生长,而未被转化的细菌则因受到抗生素的抑制而死掉。

你还参照实验手册做了下面四组对照:

对照一、在含有抗生素的培养皿上面涂布未被转化的(即不含有载体的)大肠杆菌感受态细胞(cells alone)。

对照二、用未被酶切的载体直接转化大肠杆菌感受态细胞,将产物涂布在含有抗生素的培养皿上面(vector alone)。

对照三、用BamHI酶切载体DNA后,不用碱性磷酸酶处理,不需要cDNA,直接加入DNA聚合酶,然后转化、涂板(Omit phosphatase,omit eDNA)。

对照四、除使用碱性磷酸酶外,其它与对照三相同(Omit cDNA)。

你一共做了三次实验,在第一次中所有的平板中都长出很多细菌。在第二次实验中所有的平板中都没有长细菌。在第三次实验中你得到了较好的结果,转化成功,具体克隆数见下表:

Preparation of SampleNO.of Colonies123Control 1Ceils aloneTMTC00Control 2Uneut vectorTMTC0>1000Control 3Omit phosphatase,omit cDNATMTC0435Control 4Omit CDNATMTC025Experimental sampleTMTC034TMTC=too many to count

请回答下列问题:

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第2题
下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?( )

A.质粒

B. 黏粒

C. 酵母人工染色体(YAc)

D. λ噬菌体

E. cDNA表达载体

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第3题
打算将一个cDNA克隆到一个表达载体,以便在E.coli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamH Ⅰ的位点,
因此计划将它从BamH Ⅰ的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行:载体用BamH Ⅰ切割以后,立即用碱性磷酸酶处理除去5'磷酸;接着将处理过的载体同用BamH Ⅰ切割的cDNA片段混合,加入DNA连接酶后进行温育,连接之后,将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后,将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因,所以,转化的细菌能够存活。

实验中同时设置了四个对照:

对照1:将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上。

对照2:将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。

对照3:将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。

对照4:将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。

在进行第一次实验时,感受态细胞不是自己制备的,结果在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表Q25.2)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有的平板上都没有菌落生长(表Q25.2)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(表Q25.2)。从实验平板上挑出12个菌落,分离了质粒DNA,并用BamH Ⅰ进行切割,其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带,另三个克隆中切出一个cDNA片段,实验终于获得成功。

表Q25.2 cDNA克隆的结果

制备的样品

实验结果

1

2

3

对照1 只有细胞

TMTC

0

0

对照2 未切的载体

TMTC

0

>1000

对照3 省去磷酸酶处理,无cDNA

TMTC

0

435

对照4 无cDNA

TMTC

0

25

实验样品

TMTC

0

34

注:TMTC=too many to count,多到无法计数。

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第4题
作为载体的M13噬菌体( )

A.为双链DNA分子

B.能够作为克隆基因组文库的载体

C.为单链DNA分子

D.能够克隆大于10kb的DNA片段

E.能够作为克隆cDNA文库的载体

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第5题
你在一种高效的克隆载体λYES()后在dTTP存在下与DNA多聚酶一起孵育,一个制备好的钝端cDNA与一个双链寡核苷酸接头连接,这个接头由两个寡核苷酸5’-CGAGATTTACC和5’-GGTAAATC组成,其5’-末端均有磷酸基团,然后DNA和cDNA混匀并进行连接。这个方案证实非常有效,用2μg载体和0.1mg cDNA,你可以得到4×10 7 重组分子组成的文库
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第6题
对于cDNA文库,下列叙述错的是()。

A.从cDNA文库中可筛选得到真核基因的表达序列

B.不同器官来源cDNA文库,其中各个克隆所含的DNA的片段是不完全相同的

C.cDNA文库只包含表达蛋白质或多肽基因

D.cDNA文库只包含内含子和调控区的基因

E.cDNA文库中某一克隆的扩增即是特异的cDNA克隆

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第7题
选出下列所有正确的叙述。( )

A.外显子以相同顺序存在于基因组和cDNA中

B. 内含子经常可以被翻译

C. 人体内所有的细胞具有相同的一套基因

D. 人体内所有的细胞表达相同的一套基因

E. 人体内所有的细胞以相同的方式剪接每个基因的mRNA

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第8题
将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入原核细胞的过程叫做

A.转接

B.转移

C.转导

D.转染

E.转化

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第9题
λYES(酵母一大肠杆菌穿梭载体)是构建cDNA文库的高效载体,这种载体是噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中
λYES(酵母一大肠杆菌穿梭载体)是构建cDNA文库的高效载体,这种载体是噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成,它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA被插入载体的质粒部分,然后它能在体外被包装入病毒颗粒中,包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌,λYES中的质粒序列能够被诱导重组出基因组,并进行独立复制,这就可以从质粒中分离出来,以便进行进一步的遗传操作。

为了最大限度地提高克隆效率,载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶Xho Ⅰ(5'-C↓TCGAG)进行切割,然后在dTTP存在的情况下,同DNA聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链cDNA同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来,这两段寡聚核苷酸的序列是:5'-CGAGATTTACC和5'-GGTAAATC,它们的5'端都是磷酸。然后将载体和cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用2μg的载体和0.1μg的cDNA,构建了一个有4×107个克隆的cDNA文库。问:

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